فلوسایتومتری یکی از مهمترین روشهای شناسایی و بررسی ویژگیهای سلولهاست که امروزه در تحقیقات علوم زیستی، ایمونولوژی، هماتولوژی و بسیاری از آزمایشگاههای تشخیص طبی به طور گسترده مورد استفاده قرار میگیرد. اساس این روش بر اندازهگیری نور پراکندهشده و بهویژه نور فلورسنتی است که از سلولهای نشاندارشده با رنگهای فلورسنت ساطع میشود. این رنگها که با عنوان فلوروکروم (Fluorochrome) شناخته میشوند، معمولاً به آنتیبادیها یا سایر مولکولهای اختصاصی متصل شده و امکان شناسایی دقیق آنتیژنهای سطحی و داخل سلولی را فراهم میکنند. پیشرفت چشمگیر فلوسایتومتری چندرنگ در سالهای اخیر، بیش از هر چیز، مرهون توسعه فلوروکرومهایی با روشنایی بیشتر، پایداری بالاتر و طیفهای نشر متنوعتر بوده است.
فلورسانس پدیدهای فیزیکی است که در آن یک مولکول پس از جذب نور، انرژی دریافت میکند و برای مدت بسیار کوتاهی به حالت برانگیخته میرود. این وضعیت ناپایدار بوده و مولکول به سرعت به حالت پایه بازمیگردد. در این بازگشت، بخشی از انرژی جذبشده به صورت گرما از دست میرود و بخش دیگر به شکل نور فلورسنت آزاد میشود. به همین دلیل، طول موج نور منتشرشده همواره از طول موج نوری که باعث تحریک مولکول شده است بلندتر خواهد بود. اختلاف میان این دو طول موج با عنوان جابجایی استوکس (Stokes Shift) شناخته میشود و یکی از ویژگیهای مهم هر فلوروکروم به شمار میآید، زیرا انتخاب فیلترهای نوری و آشکارسازها بر اساس همین ویژگی انجام میشود.
اگرچه تمام فلوروکرومها بر پایه همین اصل عمل میکنند، اما عملکرد آنها یکسان نیست. یکی از مهمترین شاخصهایی که در انتخاب یک فلوروکروم مورد توجه قرار میگیرد، شدت فلورسانس یا Brightness است. این ویژگی به دو عامل وابسته است؛ نخست ضریب جذب نوری (Extinction Coefficient) که بیانگر توانایی مولکول در جذب نور تحریک است و دوم بازده کوانتومی (Quantum Yield) که نشان میدهد چه نسبتی از انرژی جذبشده به صورت نور فلورسنت منتشر میشود. هرچه مقدار این دو پارامتر بیشتر باشد، سیگنال حاصل نیز قویتر خواهد بود و امکان شناسایی آنتیژنهایی که مقدار کمی از آنها روی سلول وجود دارد، افزایش مییابد.
در کنار روشنایی، ویژگیهای دیگری نیز در انتخاب فلوروکروم اهمیت دارند. برخی رنگها در اثر تابش مداوم نور بهتدریج شدت فلورسانس خود را از دست میدهند؛ پدیدهای که با عنوان Photobleaching شناخته میشود. از سوی دیگر، بسیاری از سلولها و بافتها به طور طبیعی مقداری فلورسانس زمینه تولید میکنند که به آن Autofluorescence گفته میشود. این فلورسانس طبیعی میتواند تشخیص سیگنال واقعی را دشوار کند؛ بنابراین در طراحی آزمایش، انتخاب فلوروکرومهایی با طیف نشر مناسب و حداقل همپوشانی با فلورسانس زمینه اهمیت زیادی دارد. همچنین در آزمایشهای چندرنگ، همپوشانی طیفی میان فلوروکرومها باید تا حد امکان کاهش یابد تا فرآیند Compensation با دقت بیشتری انجام شود.
فلوروکرومهای مورد استفاده در فلوسایتومتری از نظر ساختار و ویژگیهای فیزیکی در چند گروه اصلی قرار میگیرند.
فلوروکرومهای آلی کوچک (Small Organic Fluorochromes)
این فلوروکروم ها قدیمیترین و شناختهشدهترین گروه محسوب می شوند. رنگهایی مانند FITC، Texas Red، Cy5، Pacific Blue و خانواده Alexa Fluor در این دسته قرار میگیرند. این مولکولها وزن مولکولی کمی دارند، اتصال آنها به آنتیبادیها نسبتاً ساده است و طیف نشر مشخص و پایداری ایجاد میکنند. در میان آنها، FITC سالها پرکاربردترین فلوروکروم در ایمونوفلورسانس و فلوسایتومتری بود، اما حساسیت نسبتاً زیاد آن به تغییرات pH و رنگپریدگی نوری باعث شد بهتدریج رنگهایی مانند Alexa Fluor 488 که پایداری بیشتری دارند، جایگزین آن شوند.
فیکوبیلیپروتئینها (Phycobiliproteins)
گروه دیگری از فلوروکرومها هستند که منشأ طبیعی داشته و از جلبکها و سیانوباکتریها استخراج میشوند. مهمترین اعضای این خانواده Phycoerythrin (PE)، Allophycocyanin (APC) و PerCP هستند. این ترکیبات به دلیل ضریب جذب بالا و بازده کوانتومی مناسب، در مقایسه با بسیاری از فلوروکرومهای آلی سیگنال بسیار قویتری تولید میکنند و به همین دلیل برای شناسایی آنتیژنهایی با تراکم پایین انتخاب مناسبی محسوب میشوند. البته اندازه نسبتاً بزرگ این پروتئینها ممکن است در برخی شرایط باعث ایجاد ممانعت فضایی یا افزایش اتصال غیراختصاصی شود و به همین علت انتخاب آنها باید متناسب با نوع آزمایش انجام گیرد.
با افزایش تعداد پارامترهای قابل اندازهگیری در فلوسایتومتری، نیاز به فلوروکرومهایی با روشنایی بیشتر و همپوشانی طیفی کمتر نیز افزایش یافت. نتیجه این روند، معرفی فلوروکرومهای پلیمری (Polymer Dyes) بود. خانوادههای Brilliant Violet (BV)، Brilliant Blue (BB) و Brilliant Ultraviolet (BUV) از مهمترین اعضای این گروه هستند. این رنگها علاوه بر شدت فلورسانس بالا، از پایداری مناسبی برخوردارند و امکان طراحی پنلهای چندرنگ با تعداد زیادی مارکر را فراهم میکنند؛ به همین دلیل امروزه در بسیاری از فلوسایتومترهای پیشرفته بهطور گسترده مورد استفاده قرار میگیرند.
رنگهای تاندم (Tandem Dyes)
رنگهای تاندم (Tandem Dyes) در کنار گروههای گفته شده نیز از جایگاه ویژهای در فلوسایتومتری چندپارامتری برخوردارند. این فلوروکرومها از اتصال دو رنگ مختلف تشکیل شدهاند؛ بهگونهای که انرژی جذبشده توسط رنگ اول از طریق پدیده انتقال تشدیدی انرژی فلورسانس (FRET) به رنگ دوم منتقل میشود و در نهایت نور در طول موج بلندتری منتشر میشود. ترکیباتی مانند PE-Cy5، PE-Cy7 و APC-Cy7 از شناختهشدهترین رنگهای این گروه هستند. مهمترین مزیت آنها امکان استفاده از چندین فلوروکروم با یک منبع لیزر و افزایش تعداد مارکرهای قابل بررسی در یک آزمایش است، هرچند این رنگها نسبت به شرایط نگهداری حساستر بوده و تغییرات جزئی در راندمان انتقال انرژی میتواند بر نتایج آزمایش اثر بگذارد.
علاوه بر فلوروکرومهای متصل به آنتیبادی، گروه دیگری از رنگهای فلورسنت برای کاربردهای اختصاصی طراحی شدهاند. رنگهایی مانند DAPI، Propidium Iodide (PI) و 7-AAD برای رنگآمیزی اسیدهای نوکلئیک، بررسی چرخه سلولی و ارزیابی زنده یا مرده بودن سلولها استفاده میشوند. از سوی دیگر، رنگهایی مانند CFSE امکان مطالعه تکثیر سلولی را فراهم میکنند و پروتئینهای فلورسنتی نظیر GFP، YFP، CFP و mCherry نیز بهعنوان ژنهای گزارشگر در مطالعات مولکولی و سلولی کاربرد گستردهای دارند.
References:
- Robinson JP. Flow cytometry: past and future. Biotechniques. 2022 Apr 1;72(4):159-69.
- McKinnon KM. Flow cytometry: an overview. Current protocols in immunology. 2018 Jan;120(1):5-1.
- Mullins, J.M. (1999). Overview of Fluorochromes. In: Javois, L.C. (eds) Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology™, vol 115. Humana Press. https://doi.org/10.1385/1-59259-213-9:97
