فلوسایتومتری یک تکنیک استفاده شده برای تجزیه و تحلیل و مرتب سازی سلول‌ها یا ذرات بر اساس ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی آنها است. این تکنیک برای تشخیص فراوانی، درصد و ویژگی‌های فنوتایپی جمعیت‌های سلولی ایمنی یا سلول‌های نئوپلاستیک در نمونه‌هایی که از بیماران گرفته میشود، به کار می‌رود. هدف استفاده از این اطلاعات برای تشخیص بیماری، ارائه اطلاعات پیش آگهی، نظارت بر روند بیماری، یا به‌طور کلی مدیریت مراقبت از بیماران می باشد. این تکنیک در محیط‌های آزمایشگاهی بالینی و تحقیقاتی استفاده میشود. در آزمایشگاه بالینی، روش‌ها و پنل‌ها با روش‌های عملیاتی استاندارد (SOP) منطبق می‌شوند و عدم تبعیت از این SOPها معمولاً بدون فرآیند اعتبارسنجی مستند شده و تأیید از سوی یک پزشک، مجاز نمی‌باشد. بر عکس این موضوع، فلوسایتومتری در آزمایشگاه تحقیقاتی برای استفاده در محیط بالینی مناسب نبوده زیرا طراحی پنل و تنظیمات دستگاه روزانه ممکن است برای برآورده کردن نیازهای یک آزمایش خاص تغییر کند. مشکلات و هزینه‌های جاری در اداره یک آزمایشگاه فلوسایتومتری بالینی باعث میشود که فرآیند به‌روزرسانی فناوری در عملیات بالینی به صورت کندتری نسبت به محیط‌های تحقیقاتی انجام شود، با این وجود، تقاضای افزایش انجام آزمون‌های فلوسایتومتری با پیچیدگی بیشتر برای بیماران از سوی ارائه‌دهندگان خدمات بالینی و آزمایشگاه‌ها به دلیل ارائه مراقبت بالینی بهتر، بهینه‌سازی عملیات آزمایشگاه بالینی و هماهنگ‌سازی آزمایشات در حال افزایش است.
فلوسایتومتری سنتی (Conventional)که بر اساس شناسایی نشر فلورسانس با استفاده از تعداد محدودی دتکتور (آشکارساز) مجزا قابل انجام است که هرکدام به آنالیز فلوروکروم‌های خاص می‌پردازند.
فلوسایتومتری طیف کامل یا Full spectrum ، همچنین به نام فلوسایتومتری طیفی یا سایتومتری طیفی شناخته میشود، یک پیشرفت جدیدتر در فناوری سایتومتری است. این تکنیک شامل گرفتن تمام طیف انتشار فلوروکروم‌ها میشود،که امکان تحلیل پیچیده‌تر و طراحی پنل بهتری را فراهم میکند.
کاربرد فلوسیتومتری طیفی در ابتدا توسط گروه پوردو در نشست انجمن بین المللی سایتولوژی تحلیلی (ISAC) در سال 2004 ارائه شد، با یک پتنت که برای این فناوری در سال 2007 برای دانشگاه پردو صادر شد. فلوسایتومتری طیفی به سرعت در حال پیشی گرفتن از فلوسایتومتری سنتی است و در این وبلاگ به اصول اولیه و مزایای آن نسبت به فلوسایتومتری معمولی می پردازیم.
فلوسایتومتری Full spectrum عمدتاً در حوزه‌های تحقیقاتی مورد استفاده قرار میگیرد که تجزیه و تحلیل جامع ویژگی‌های سلولی ضروری است. این حوزه‌ها شامل ایمنی‌شناسی، تحقیقات سرطان، بیولوژی سلول‌های بنیادی و ایمونوفنوتایپینگ میشود. این تکنیک برای مطالعه زیرگروه‌های سلولی ایمنی، سیگنال‌دهی داخل‌سلولی، تجزیه و تحلیل چرخه سلول، آپوپتوز، بررسی روند تکثیر و سایر موارد به کار می‌رود.
فلوسایتومتری Full spectrum به عنوان یک فناوری پیشرفته، برخی از محدودیت‌های فلوسایتومتری سنتی را با گرفتن کل طیف انتشار فلورسانس، از بین برده است و این امکان را فراهم میکند که تحلیل داده‌ها به صورت جامع و انعطاف‌پذیرتری انجام شود، که این ابزار را در ایمونولوژی، بیولوژی سلولی و سایر زمینه‌ها ارزشمند میسازد.
full spectrum flowcytometry در حال حاضر بسیاری از فلوسایتومترهای بالینی نیز در سراسر جهان مورد استفاده قرار میگیرد. در این سایتومترها، هر لیزر فلورفورها را تحریک کرده و نور منتشره از آنها از آینه‌های دیکرویکی(آینه های دو رنگی) و فیلترهای با باندپهن (Longpass) عبور کرده و فقط طول‌موج مشخص و بسیار دقیقی از نور را به سیستم دیتکتور اجازه عبور می‌دهد.
فلوسایتومتری طیفی با فلوسیتومتری معمولی متفاوت است زیرا از منشورها برای گرفتن تمام نور ساطع شده از فلوروفورهای تحریک شده در مجموعه‌ای از دتکتورها یا مجموعه ای از کانال‌ها جمع آوری میشود.(این درحالیست که پیش ازین از فوتون‌های نشر شده در دتکتورهای جداگانه جمع آوری می شدند) (شکل 1). این بدان معناست که در فلوسیتومتری سنتی به طور موثر سیگنال‌های فلوروفورهای خاص را در طول موج‌های تعریف‌شده شناسایی میکند، درحالی که فلوسیتومتری طیفی تمام مشخصات طیفی فلوروفورها را از چندین لیزر جمع‌آوری میکند که امضای طیفی (spectral signature) نیز نامیده میشود.
شکل ۱. مقایسه عملکرد فلوسایتومتری سنتی و Full Spectrum
فلوسایتومتری معمولی یک تکنیکی می‌باشد که یک لوله با تقریباً 3 تا ۱۰ آنتی‌بادی در هر لوله میتوان ترکیب کرد. فلوسایتومتری نسل جدید به عنوان یک روشی تعریف میشود که شامل تعداد کمتری از لوله‌ها با تعداد بیشتری از آنتی‌بادی‌ها در هر لوله (8 آنتی‌بادی به بالا) و اغلب کوکتل‌های آنتی‌بادی از پیش تعیین شده برای تسهیل تشخیص برخی از بیماری‌ها است. آزمایشگاه بالینی حجم زیادی از نمونه‌ها را برای آنالیزهای فلوسایتومتری معمولی دریافت میکند و یک مشکل همیشگی تعداد نمونه‌هایی است که به دلیل سلول کم یا تعداد سلول زنده کم نمی‌توان آنها را تجزیه و تحلیل کرد که با این تکنیک جدید امکان بررسی تعداد بیشتری از مارکرهای سلولی ضمن خوانش یک لوله فراهم میشود.
عوامل مختلفی می‌تواند بر نتایج آنالیز فلوسایتومتری اثر بگذارد از جمله:
(الف) تعداد سلول/ مقدار جمعیت سلولی زنده
(ب) مدت زمان بین جمع‌آوری نمونه و تا آماده سازی و خوانش با دستگاه
(ج) جمعیت بیمار.
دتکتورها در فلوسایتومتری سنتی معمولاً از نوع (Photomultiplier tube)PMT می‌باشند اما می‌توانند همچنین photo avalanche diodes باشند، که حساس‌تر هستند و در امروزه متداول تر می‌باشند. در فلوسایتومترهای معمولی، برای هر فلورفور، یک ترکیب فیلتر/دتکتور وجود دارد، و سپس مقادیر معلوم از همپوشانی طیفی با استفاده از compensation و با کنترل‌های تک رنگ اصلاح می‌شوند. در حالی که Full spectrum امکان تشخیص یک طیف گسترده را فراهم میکند. بعد از رنگ آمیزی سلول‌ها با ترکیبی از آنتی‌بادی‌های متصل به فلورفورهای مختلف هر لیزر هر فلورفور را تحریک میکند و تمام نور نشر شده دیتکت میشود. اغلب 8 تا 16 کانال مرتبط با هر لیزر (تعداد بیشتر یا کمتر ممکن است) وجود دارد، که هر کانال دارای یک (Photo Diode Array) PAD است که نور انتشاری را در یک باند باریک از طول‌موج‌ها اندازه‌گیری میکند.
فلوسایتومتری Full spectrum از این ایده بهره می‌برد و توسط سه شرکت SONY، Cytek و پروپل، (جدیدترین ورودی به این حوزه) تجاری‌سازی شده است. یکی از مزایای full spectrum flowcytometry کامل، گرفتن فلورسانس ذاتی یا اتوفلورسنس (AF) سلول‌ها می‌باشد و استفاده از آن به عنوان یک طیف جداگانه امکان پذیر است که برای حذف AF استفاده میشود و این امکان را به دست می‌دهد که وضوح بهتری از سیگنال واقعی داشته باشد.
در فلوسایتومتری Conventional محدودیت در استفاده از رنگ وجود دارد و هر دتکتور توانایی ثبت یک نشر نوری را دارد و مقادیری از طیف نشری بدلیل وجود فاصله بین فیلترهای هر دتکتور نادیده گرفته میشود (شکل ۲) اما در فلوسایتومتری Full spectrum تمام دتکتورها، آغاز تا پایان نشر یک فلورسنس را ثبت میکند و بمانند اثر انگشت، تمام طیف ایجاد شده را ثبت میکند (شکل ۲) و قابلیت استفاده دو رنگ با نشر یکسان مانند FITC و GFP قابل استفاده می‌باشد.
شکل ۲. مقایسه فلوسایتومتری Conventional و Full spectrum و نادیده گرفته شدن بخشی از طیف و همپوشانی در فلوسایتومتری سنتی
در فلوسایتومتری سنتی همانطور که گفته شد جهت تصحیح همپوشانی از روش Compensation استفاده میشود اما در Full spectrum از روش Unmixing که هر طیف را به طور کامل از سایر طیف‌ها جدا میکند (شکل ۳).
شکل۳. تفکیک طیف‌های نشری هر فلوروکروم به روش Unmixing
مزایا : Full spectrum
فلوسایتومتری طیفی کامل قادر است چندین فلوروکروم را در یک کانال اندازه‌گیری کند، که امکان استفاده از تعداد بیشتری از فلوروکروم‌ها در یک پنل واحد را فراهم میکند. این باعث افزایش پیچیدگی آزمایشات و امکان شناسایی پارامترهای بیشتر در هر نمونه میشود باعث صرفه جویی در زمان و هزینه میشود.
کاهش compensation: فلوسایتومتری سنتی چند رنگ نیاز به compensation دارد تا همپوشانی طیفی بین فلوروکروم‌ها را اصلاح کند. full spectrum flowcytometry می‌تواند نیاز به compensation را به دلیل قابلیت‌های طیفی خود کاهش دهد، زیرا تمام طیف نشری را دریافت میکند که می‌تواند به تجزیه و تحلیل دقیق‌تر داده‌ها منجر شود.
حساسیت بهتر: full spectrum flowcytometry می‌تواند تفاوت بهتری بین سیگنال و نویز پس‌زمینه(Background) فراهم کند و حساسیت به شناسایی مارکرهای بافراوانی کم (Rare Antigens) را افزایش دهد.
طراحی پنل انعطاف‌پذیر: full spectrum flowcytometry امکان طراحی پنل با انعطاف بیشتری را فراهم میکند، زیرا محدودیت‌های مربوط به ویژگی‌های طیفی دتکتورهای سنتی وجود ندارد. این می‌تواند منجر به آزمایشات موثرتر و سفارشی‌تر شود.
تشخیص چندرنگ: full spectrum flowcytometry کامل از طیف گسترده‌ای از رنگ‌های فلورسانت استفاده میکند، هرکدام نور را در طول موج مشخصی در هنگام تحریک توسط یک لیزر منتشر می‌کنند. این رنگ‌ها می‌توانند به مارکرهای مختلف سلولی، مانند آنتی‌ژن‌های سطحی، پروتئین‌های داخل‌سلولی و اسیدهای نوکلئیک متصل بشوند.
دتکتورهای بسیار حساس: در این تکنیک، از دتکتورهای نوری بسیارحساس یا دتکتورهای با دامنه تشخیص وسیع استفاده میشود. این دتکتورها قادرند به طور همزمان امواج منتشره از چندین فلوروکروم را جذب کنند، حتی اگر طول موج مشابهی انتشار دهند.
افزایش چندپارامتری: Full spectrum اندازه‌گیری تعداد بیشتری از پارامترها به صورت همزمان را ممکن میسازد. که می‌تواند شامل شناسایی مارکرهای سطحی، سایتوکاین‌های داخل‌سلولی، فازهای چرخه سلولی، مارکرهای آپوپتوز و موارد دیگر باشد، همه در یک آزمایش!
بهبود رزولوشن: گستره طیفی زیاد و دتکتورهای پیشرفته، رزولوشن بهتری ایجاد می‌کنند و تفکیک بین مارکرهای با بیان کم یا جمعیت‌های سلولی با ویژگی‌های نزدیک به هم را آسان‌تر میکند.
تجزیه و تحلیل جامع داده: تجزیه و تحلیل داده در full spectrum flowcytometry کامل شامل استفاده از نرم‌افزارهای ویژه است که قادر به کنترل پیچیدگی اطلاعات چندرنگی است. محققان می‌توانند نمودارهای دقیق تر را تولید کرده و تجزیه و تحلیل‌های آماری عمیق‌تر و با ابعاد بالا (High-Dimensional) را انجام دهند.
کاربردها: full spectrum flowcytometry کامل به خصوص در ایمونولوژی، تحقیقات حوزه سرطان، زیست‌شناسی سلول‌های بنیادی و سایر حوزه‌هایی که شناسایی دقیق جمعیت‌های سلولی پیچیده اساسی است، ارزشمند است. این می‌تواند به محققان کمک کند تا درک عمیق‌تری از عملکرد‌های سلولی، پاسخ‌های ایمنی، مکانیسم‌های بیماری و هدف‌های درمانی پیدا کنند.
معایب:
هزینه: سیستم‌های فلوسیتومتری طیف کامل معمولاً گران‌تر از فلوسیتومترهای سنتی هستند که باعث کاهش دسترسی برخی پژوهشگران میشود.
پیچیدگی تحلیل داده: تجزیه و تحلیل داده‌های طیفی ممکن است پیچیده‌تر باشد نیاز به آموزش توسط افراد مجرب دارد.
ابزار و نگهداری: فلوسیتومترهای با طیف کامل ممکن است به نگهداری بیشتر و اپراتورها یادگیری بیشتری نیاز داشته باشند.
آینده:
تجزیه و تحلیل سلولی با ابعاد بالا به مدت طولانی محرک اصلی برای توسعه فناوری فلوسیتومتری بوده و تأثیر آن بر توسعه full spectrum flowcytometry هم استثنا نیست. در حال حاضر، همانطور که برای بسیاری از وجود این حوزه اتفاق افتاده است، بیشتر فلوسایتومترهای تجاری برای تحلیل ایمونوفنوتایپ لنفوسیت‌ها با استفاده از آنتی‌بادی‌ها و پروب‌های فلورسانسی طراحی شده‌اند و نسل فعلی فلوسایتومترهای طیفی به نظر می‌رسد در این زمینه عملکرد بسیار برتری داشته باشد.
