در این مقاله هدف، بررسی بروز کایمریسم گلبول های قرمز پس از پیوند مغز استخوان به روش فلوسایتومتری می باشد.

کایمریسم:

کایمریسم به حضور پایدار سلول های غیرخودی در گیرنده پیوند یا میزبان اطلاق می شود. کایمریسم یکی از پیامدهای قابل انتظار پیوند است و در شرایطی خاص پس از انتقال خون و در دوران بارداری در نتیجه تردد دو جانبه سلول های زنده بین مادر و جنین نیز دیده میشود. کایمریسم به صورت کامل ( جایگزینی کامل سلول های گیرنده و دهنده) و یا مخلوط ( جایگزینی برخی از رده های سلولی درگیرنده با سلول های دهنده) و یا میکروکایمریسم  ( جایگزینی کمتر از 5/2 % سلول های گیرنده با سلول های دهنده) می باشد. بروز کایمریسم بیانگر موفقیت پیوند و دوام آن شناخته شده است. از انجایی که پی گیری و کنترل بیماران پس از پیوند مغز استخوان در ارزیابی پیوند بسیار حیاتی است، شناسایی کایمریسم مخلوط و یا کامل بسیار مفید و ارزشمند می باشد.

بررسی سلول های پیش ساز خونی در نمونه مغز استخوان گیرنده پیوند بسیار ارزشمند است، ولی انجام مکرر آن مقدور نیست. بنابراین شناسایی زود هنگام کایمریسم در گلبول های قرمز خون محیطی معیاری است که اخیرا جهت کنترل و پی گیری بیمارانی که تحت پیوند مغز استخوان قرار گرفته اند مورد استفاده قرار می گیرد. رایج ترین روش برای شناسایی کایمریسم گلبول های قرمز، آگلوتیناسیون افتراقی گلبول قرمز است. علیرغم پیشرفت های حاصل شده در روش آگلوتیناسیون، این روش از تکرار پذیری کمی برخوردار است و همچنینی حساسیت آن پایین می باشد.

فلوسایتومتری از جمله جدیدترین تکنیک های است که اخیرا در بررسی میکروکایمریسم ( جمعیت های مخلوط گلبول های قرمز) نیز از آن استفاده شده است. فلوسایتومتری علاوه بر سنجش و شناسایی کایمریسم از طریق شناسایی آنتی ژن های خاص در دهنده و گیرنده، امکان تشخیص هموزیگوت و یا هتروزیگوت بودن آنتی ژن های رایج گلبول های قرمز  را نیز فراهم می آورد.

استفاده از فلوسایتومتری با دو رنگ مختلف فلوروسانس، امکان بررسی آنتی ژن های سطحی رتیکولوسیت ها در جمعیت مخلوط را مسیر می سازد. در سال 1994 با استفاده از فلوسایتومتری به بررسی آنتی ژن های گروه های خونی روی رتیکولیست پرداختند و به این ترتیب بررسی کایمریسم در افرادی که اخیرا خون دریافت کرده اند نیز امکان پذیر شد.

روش انجام آزمایش:

نوع مطالعه مقطعی بوده و برای انجام این مطالعه از آنتی بادی های ضد گروه های خونی ABH ,Rh ,Kell, Duffy, Kidd, MNS که با ماده فلوروسانس FITC نشان دار شده اند استفاده گردید. 14 بیمار مبتلا به بدخیمی های هماتولوژیک که تحت پیوند مغز استخوان قرار گرفته بودند، جهت جمعیت مورد مطالعه انتخاب شدند. نمونه مورد نیاز 5 میلی لیتر خون محیطی ( در لوله حاوی EDTA) بود. ابتدا فنوتیپ گلبول های قرمز دهندگان و گیرندگان پیوند با هر دو روش آگلوتیناسیون و فلوسایتومتری تعیین و سپس در روز های 15،30 و 60 پس از پیوند، فقط نمونه خون محیطی گیرنده از لحاظ آنتی ژن هایی که بین دهندگان و گیرنده متفاوت بودند توسط فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفت. آزمایش جستجوی آنتی بادی و سنجش تیتر ایزوهم آگلوتینین در نمونه پلاسمی بیماران قبل از پیوندو روز 60 پس از پیوند انجام شد.

یافته ها

یافته ها نشان میدهد که همه بیماران مورد بررسی کایمریسم را بروز داده اند، به عبارتی در 9 نفر (64%)، در روز پانزدهم پس از پیوند و در 5 نفر (36%)، 30 روز پس از پیوند، کایمریسم (پدیدار شدن گلبول های قرمز حاوی آنتی ژن های گروه های خونی دهنده) مشاهده شده است. در بین افرادی که کایمریسم را در 15 روز پس از پیوند بروز داده اند، نسبت بیماران مونث بیشتر از بیماران مذکر می باشد. به عبارتی زمان مشاهده کایمریسم در بیماران مونث زودتر از بیماران مذکر است. با انجام تست غربالگری آنتی بادی بر روی نمونه های پلاسمای جمع آوری شده در روزهای قبل از پیوند و روز 60 پس از پیوند، مشاهده شده که هیچ آنتی بادی از کلاس IgG و IgM در گیرندگان پیوند وجود ندارد و تا 60 روز پس از پیوند نیز تولید نشده است. همچنین در کلیه بیمارانی که علی رغم ناسازگاری ABO تحت پیوند مغز استخون قرار گرفته بودند، کایمریسم گلبول قرمز مشاهده شده است.

یافته ها بیان میدارد که بیمارانی که داروی فلودارابین مصرف نموده اند در 15 روز اول پس از پیوند کایمریسم را نشان داده اند. بنابراین استنتاج می گردد که داروی فلودارابین باعث تاخیر در زمان مشادهده کایمریسم  نمی شود.

بحث

نتایج بیان میدارد که بررسی وقوع کایمریسم در گلبول های قرمز به روش فلوسایتومتری انجام پذیر است، در کلیه بیماران تحت بررسی وقوع کایمریسم بین روزهای 15-30 پس از پیوند مشاهده گریده، وقوع کایمریسم در گلبول های قرمز با مصرف فلودارابین ارتباطی ندارد و بروز کایمریسم وقوع GVHD را کاهش می دهد. تاکنون پیوند کامل با موفقیت 100% حاصل نشده است و احتمال رد پیوند، عود بیماری و GVHD پس از پیوند وجود دارد. از آنجایی که عود بیماری و رد پیوند با ظهور مجدد سلول های خونساز با منشا گیرنده همراه است، پیگیری و کنترل بیماران پس از پیوند مغز استخوان در ارزیابی پیوند و اقدامات درمانی، مناسب و بسیار حیاتی است. روش های مختلفی به منظور ارزیابی و شناسایی سریع سلول های خودی گیرنده و پیش بینی عوارض فوق از قبیل روش های سیتوژنیک و روش مولکولی که پرهزینه و وقت گیر می باشند، به کار گرفته شده است. بررسی سلول های پیش ساز خونی با استفاده از نمونه  های بیوپسی و آسپیرآسیون مغز استخوان گیرندگان، بسیار ارزشمند است ولی تکرار آن به دفعات مقدور نیست.

درحال حاضر ارزیابی کمی جمعیت های مخلوط در بیمارانی که تحت پیوند مغز استخوان قرار گرفته اند توسط تکنیک فلوسایتومتری امکان پذیری بوده و حداقل جمعیت قابل شناسایی با این روش (1-0.1 درصد) می باشد.

فلوسایتومتری امکان بررسی تعداد زیادی سلول در زمان کوتاه را فراهم می سازد لذا به ویژه برای ردیابی تعداد اندکی سلول و کنترل و پی گیری روتین بیماران پس از پیوند مغز استخوان مناسب است. در این روش آنتی ژن های گروه های خونی اصلی و فرعی به صورت غیر مستقیم توسط FITC نشان دار می شوند. شدت فلوروسانس ساطع شده از گلبول قرمز مثبت از لحاظ آنتی ژن مورد بررسی از فردی به فرد دیگر متفاوت است، این اختلاف عمدتا به دلیل تفاوت در تراکم آنتی ژن ها و در دسترس بودن آنهاست. اولین کاربرد روش فلوسایتومتری در شناسایی جمعیت های مخلوط گلبول قرمز در شدت خونریزی مادر و جنین توسط Nance و همکاران گزارش شده است پس از روش های Blancherd و Hendrike روش فوق را به بررسی کایمریسم گلبول های قرمز پس از پیوند مغز استخوان توسعه داد و حساسیت روش را به 0/1  تا 1 درصد رساندند. با استفاده از دو رنگ فلورسانس در فلوسایتومتری می توان بررسی رتیکولیست ها پرداخت که این کار امکان تشخیص سریع کایمریسم را فراهم می سازد. همچنین با این کار پیگیری کلیه بیمارانی که به تازگی نیز خون در یافت کرده اند، تسهیل می شود. از آنجایی که بررسی رتیکولیست در بیماری PNH ضروری است فلوسایتومتری امکان کنترل و پیگیری دقیق تر بیمارانی که دچار عارضه هستند را فراهم می سازد.

روش فلوسایتومتری به خوبی قادر به ردیابی کایمریسم در کلیه بیمارا تحت بررسی بوده است. 36 % از بیماران تحت مطالعه در روز  30 پس از پیوند و 64% از آنان در روز 15 پس از پیوند کایمریسم واضح را نشان دادند. داده ها بیانگر آن است که درصد افرادی که کایمریسم را در روز 30پس از پیوند نشان داده اند، در بین این دسته از بیماران بیشتر است.

در حال حاضر آنتی بادی قابل استفاده در فلوسایتومتری علیه مهم ترین آنتی ژن های گروه های خونی به صورت تجاری در دسترس می باشند. به این ترتیب امکان بررسی و کنترل بیمارانی که تحت پیوند مغز استخوان آلوژنی قرار می گیرند از طریق کنترل حداقل یک آنتی ژن گروه خونی متفاوت بین دهنده – گیرنده وجود دارد. با توجه به موفقیت راه اندازی روش بررسی فنوتیپ گلبول قرمز با فلوسایتومتری و نتایج مطالعات گوناگون تایید میگردد که فلوسایتومتری روشی ساده و سریع به منظور تشخیص جمعیت های مخلوط گلبول قرمز است . این روش نسبت سایر روش ها در زمان کوتاهتر و نتایج دقیق تری را در اختیار ما قرار می دهد.

با توجه به امکان بررسی رتیکولیست ها با استفاده از فلوسایتومتری دو رنگ، امکان بررسی کایمریسم در کلیه افرادی که اخیرا نیز انتقال خون داشته اند ممکن می باشد. با توجه به موفقیت این مطالعه در راه اندازی روش فلوسایتومتری برای بررسی جمعیت های دوگانه گلبول قرمز پیشنهاد می گرددکه مطالعه وسیع تر با پیگیری بیماران در مدت زمان بیشتر پس از پیوند و به طور همزمان با سایر روش های مولکولی در مورد عود بیماری صورت پذیرد، زیرا در صورت عود بیماری، درصد گلبول های قرمز که دارای آنتی ژن های گروه خونی گیرنده هستند، پس از یک دوره کاهش، مجددا افزایش می یابد.