سنجش زنده بودن اشکال کوکوئید هلیکوباکتر پیلوری به روش فلوسایتومتری

کشف هلیکوباکتر پیلوری به عنوان یک پاتوژن انسانی و ارتباط آن با بیماری های زخم معده و اثنی عشر، لمفوما و سرطان معده، این باکتری را بعنوان یکی از مهم ترین یافته های علم پزشکی قرن معرفی کرده است. علی رغم تمام مطالعات انجام شده بر روی هلیکوباکتر پیلوری هنوز بسیاری از مسائل مانند مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری، راه انتقال، ریشه کنی و عود مجدد بیماری ناشناخته است. هلیکو باکتر پیلوری باکتری گرم منفی و اسپریل است که در کشت های کهنه به فرم کوکوئید دیده می شود. بعلاوه اشکال کوکوئید غیر قابل کشت در محیط های کشت آزمایشگاهی هستند که در اثر تغییرات PH، افزایش اکسیژن و اثر مواد ضد میکروبی مانند آنتی بیوتیک ها نیز به وجود میآیند. تا مدت ها تصور میشد این اشکال مرده و غیر فعال هستند ولی امروزه عده زیادی از محققان بر این باورند که اشکال کوکوئید زنده و از لحاظ متابولیکی فعال هستند. در صورت زنده بودن اشکال کوکوئید می توان آنها را بعنوان یکی از عوامل مهم بسیاری از مسائل مربوط به هلیکوباکتر پیلوری مانند مقاومت به آنتی بیوتیک در نظر گرفت.

محققان با روش های معتددی مانند PCR، میکروسکوپ الکترونی و اتورادیگرافی زنده بودن اشکل کوکوئید هلیکوباکتر پیلوری را اثبات کردند. با توجه به پیچیده بودن، وقت گیر بودن و سختی کار با این روش ها استفاده از روشی سریع، قابل دسترس و ساده برای تعیین زنده بودن اشکال کوکوئید باکتری هدف این تحقیق بوده است. در PCR  نیاز به استخراج DNA و تهیه پرایمر ها و آنزیم DNA پیلمراز مقاوم به حرارت دارد و نیز طی مراحل مختلف صورت می گیرد. کار با میکروسکوپ الکترونی نیاز به آماده سازی نمونه دارد که باید با دقت و مهارت زیادی انجام شودو بسیار وقت گیر است. در این تحقیق برای اولین بار از روش سریع، حساس و ساده فلوسایتومتری برای اثبات زنده بودن اشکال کوکوئید هلیکوباکترپیلوری استفاده شد که نیازی به آماده سازی نمونه و مراحل طولانی ندارد و در مدت زمان کوتاه نتایج را بر اساس خصوصیات فیزیکی و شیمیایی سلول های موجود در یک جریان مایع همانطور که از عدسی ها و سنسورها می گذرند ارائه می دهد.

مواد و روش

10 نمونه از بیوپسی بیماران مبتلا به عفونت با هلیکوباکتر پیلوری که در بخش گوارش بیمارستان دکتر شریعتی بستری بودند دریافت شد و پس از انجام تست های تاییدی مانند اوره آز روی محیط کشت کلمبیا آگار همراه با سرم اسب 10% کشت داده شدند و در شرایط میکروآئروفیل ( 5% اکسیژن، 10% دی اکسید کربن و 85% نیتروژن) به مدت 48-36 ساعت در انکوباتور نگه داشته شدند. مجددا نمونه ها در محیط مایع بروسلای مکمل شده با FETAL CALF SERUM 6 درصد کشت داده شده و در شرایط میکروآئروفیل انکوبه شده استفاده شد. برای بدست آوردن نمونه های اسپریل باکتری از کشت های تازه به مدت 10 روز انکوبه شده بودند استفاده گردید. برای اطمینان از مورفولوژی باکتری از کشت های مذکور رنگ آمیزی گرم تهیه شد و با میکروسکوپ مشاهده گردید. در مرحله بعد از هر دو فرم اسپریل و کوکوئید هلیکوباکتر سوسپانسیون مایع در سرم فیزیولوژی تهیه شد و کدورت محیط به 1 مک فارلند که معادل CFU/ml است رسید و سپس برای هر نمونه نیز کنترل های مثبت و منفی تهیه شد. کنترل مثبت شامل باکتری های زنده فرم اسپریل و کوکوئید بود ولی کنترل منفی از نمونه های کشته شده با 200 میکرولیتر محلول هیپوکلریت سدیم 5% که به نسبت 10 به 10 با آّب مقطر رقیق شده بود تهیه شد، همه نمونه ها به مدت 30 دقیقه در آزمایشگاه نگهداری شدند تا برای انجام مرحله فلوسایتومتری آماده شوند. ابتدا سوسپانسیون های حاوی نمونه های کنترل مثبت و کنترل منفی که به ترتیب حاوی باکتری های زنده و مرده از هر دو فرم اسپریل و کوکوئید بودند در دور 1000g به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند و به رسوب باقی مانده 2 میلی لیتر محلول 5 مولار بافر فسفات اضافه و مجددا در دور 1000 g به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. رسوب به دست آماده جدا شده و به آن 1 میلی لیتر رنگ رود آمین 123 که یک رنگ فلوروسنت است اضافه شد و نمونه های آماده شده با یک فلوسایتومتر با طول موج 488 نانومتر و پارامتر های FSC, SSC و ولتاژ 600 ولت آنالیز شدند و نتایج آزمایش به صورت هیستوگرام به دست آمد.

نتایج

شکل 1 ( الف، ب) نمونه های رنگ آمیزی شده اشکال اسپریل و کوکوئید هلیکوباکتر پیلوری با روش رنگ آمیزی گرم نشان می دهد. همانطور که در شکل 2 الف نشان داده شده، همه آنالیز نمونه ها در محدوده متراکم باکتریایی (R) که در شکل مشخص شده است انجام گرفته، در شکل 2 (ب) نشان داده شد که در کنترل مثبت اشکال اسپریل هلیکوباکتر پیلوری 92% باکتری ها زنده هستند و بالانرین میزان جذب رنگ رودآمین 123 را نشان می دهند ولی در نمونه های کنترل منفی (ج) میزان جذب رنگ در پایین تر حد است. در نمونه های کنترل مثبت اشکال کوکوئید هلیکوباکتر پیلوری 98/94 % باکتری ها رودآمین 123 را جذب کرده اند شکل 3 (الف) و در نمونه های کنترل منفی تنها 3/14% سلول هازنده بودند و رنگ را جذب کرده اند. شکل 3 (ب)

بحث و تفسیر

Resenick برای اولین بار از فلوسایتومتری برای تعیین زنده بودن باکتری Mycobacterium Semegmatic در سال 1982 استفاده کرد. Diaper نیز این روش را به دلیل ساده و در دسترس بودن به سایر روش هایی که جهت تعیین زنده بودنباکتری ها به کار رفته است ترجیح داد. هدف از این تحقیق اثبات زنده بودن اشکال کوکوئید هلیکوباکتر پیلوری با استفاده از فلوسایتومتری است. هلیکوباکتر پیلوری عامل زخم های معده و اثنی عشری و سرطان معده است. این باکتری دارای دو فرم اسپریل و کوکوئید است. اشکال کوکوئید تحت شرایط نامناسب محیطی مانند افزایش اکسیژن، تغییرات PH، افزایش اکسیژن و اثر ضد میکروبی به وجود می آیند. مدت ها زنده بودن اشکال کوکوئید باکتری یک معما بوده است. برخی از محققین تصور می کردند که کوکوئید مورفولوژی اشکال مرده باکتری است ولی گروهی نیز بر این باورند که آنها به دلیل دارا بودن غشاهای سیتوپلاسمی سالم و دست نخورده و بیان اغلب ژن های بیماریزا باکتری مانند ژنهای Cag A، Vac A، Ure A و نیز وجود DNA و RNA اشکال زنده باکتری می باشند. بسیاری از محققان با روش های سختی مانند اتورادیگرافی، PCR و میکروسکوپ الکترونی توانسته زنده و فعال بودن اشکال کوکوئید که در محیط های کشت آزمایشگاهی غیرقابل کشت هستند را اثبات کنند. توانایی تشخیص سریع و دقیق، مجزا کردن و شناسایی سلول ها در یک جمعیت میکروبی فلوسایتومتری را به عنوان یک روش مناسب برای آنالیز نمونه های میکروبی از جمله زنده بودن باکتری ها معرفی کرده است بیشتر رنگ های استفاده شده در فلوسایتومتری جهت سنجش زنده بودن باکتری ها رنگ های کاتیونی مانند رودآمین 123 هستند که تمایل به تجمع در غشاهای داخلی باکتریایی دارند در این تحقیق با استفاده از روش فلوسایتومتری و رنگ رودآمین 123 و پس از آنالیز نمونه ها و بررسی هیستوگرام ها به دست آمده توسط دستگاه نشان داده شد که در نمونه های کنترل مثبت هر دو فرم کوکوئید و  اسپریل که حاوی درصد بالایی از باکتری های زنده بودند توانایی جذب رنگ رودآمین 123 در بالاترین میزان بود. شکل 2 (ب) و شکل  3 (الف). ولی در نمونه کنترل منفی در هر دو فرم که حاوی باکتری های کشته شده با هیپوکلریت سدیم بودند جذب رودآمین در پایین ترین میزان بود. شکل 2(ج) و شکل 3(ب). در باکتری های زنده، رودآمین از طریق غشای سیتوپلاسمی جذب نمی شود. با توجه به اینکه جذب رودآمین از طریق غشای سیتوپلاسمی باکتری ها و فعالیت تنفسی متابولیکی صورت می گیرد، مقایسه هیستوگرام جذب رنگ رودآمین در اشکال زنده فرم اسپریل و کوکوئید نشان داد که اشکال کوکوئید نسبت به بسیاری از استرس های محیطی مقاوم می باشند همانند فرم اسپریل زنده و دارای فعالیت متابولیکی هستند ولی میزان فعالیت آنها 2-3 بار کمتر از اشکال اسپریل هلیکوباکتر پیلوری است. در واقع اشکال کوکوئید اشکال مقاومی هستند که در شرایط نامساعد محیطی ایجاد شده و تا ایجاد شرایط مناسب با حداقل فعالیت حیاتی و بدون رشد و تکثیر به حیات خود ادامه می دهند. اما اینکه هلیکوباکتر پیلوری بتواند در آب در یک فاز فعال متابولیکی و نه در حال رشد زنده بماند از مهمترین عوامل انتقال باکتری از طریق محیط های آّبی محسوب می شود. بنابراین با اثبات زنده بودن اشکال کوکوئید هلیکوباکتر پیلوری می توان این مسئله را عنوان کرد که شکل کوکوئید باکتری مقاومت بالای می دهد و شاید علت اصلی مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری و تفاوت حساسیت آنتی بیوتیکی هلیوباکتر پیلوری و نیز عاملی برای عود مجدد بیماری و نقص درمان عفونت با این باکتری اشکال کوکوئید باشند که با تحقیق بیشتر بر روی اشکال کوکئوئید هلیکوباکتر پیلوری بتوان به حل مشکلات مرتبط با این باکتری کمک فراوانی کرد. به علاوه با توجه به ساده، حساس و در دسترس بودن فلوسایتومتری و نیز به دلیل اینکه در مدت زمان کوتاه بدون نیاز به آماده سازی اختصاصی نمونه ها و مراحل طولانی مانند آنچه در روش PCR و یا اتورادیوگرافی و میکروسکوپ الکترونی مورد نیاز است، انجام می شود. روش فلوسایتومتری بعنوان روش مناسب جهت تعیین زنده بودن باکتریایی معرفی می شود.