آپوپتوز و فلوسایتومتری

در سال 1972دانشمندی به نام کر برای اولین بار واژه آپوپتوز را به معنای ریزش برگ برای توصیف مرگ فیزیولوژی سلول معرفی کرد  آپوپتوزیس یک فرایند فیزیولوژیکی حیاتی برای رشد طبیعی و همچنین حفظ هموستازی است. زمانی که سلول تحت تاثیر عوامل مختلف محیطی و یا حتی درونی همانند اشعه های یونیزان، دارو های سیتوتوکسیک، هورمون های گلوکوکورتیکوئیدی و عوامل دیگر قرار می گیرند، محتویات آن از جمله DNAدستخوش تغییراتی می شود که در صورت ادامه حیات آن منجر به ناهنجاری هایی در سلول می شود.

تفاوت های آپوپتوز و نکروز

 در آپوپتوزیس غشا بدون اینکه انسجام خود را از دست بدهد به صورت حفره حفره در می آید اما در نکروز غشا انسجام و یکپارچگی خود را از دست می دهد. آپوپتوزیس با چروکیدگی سیتوپالسم و تراکم هسته آغاز می شود اما نکروز با متورم شدن سیتو پالسم و میتوکندری همراه است. آپوپتوزیس باتشکیل حفرات غشایی به نام اجسام آپوپتوتیک همراه است اما نکروز بدون تشکیل این حفرات و تا لیز کامل سلول پیش می رود. در نکروز تعادل یونی محیط در داخل و خارج سلول از بین می رود اما در آپوپتوزیس طی واکنش های آنزیمی فعال این تعادل حفظ می شود. نکروز به انرژی نیاز ندارد اما آپوپتوزیس با مصرف انرژی به ATP وابسته است. در نکروز DNA به صورت تصادفی در جایگاه های غیر اختصاصی شکسته می شود اما درآپوپتوزیس این شکستگی ها تصادفی نیست و در فواصل بین نوکلئوزوم ها رخ می دهد. در آپوپتوزیس فاکتور هایی مثل سیتوکرومC ، اندونوکلئاز SMAC ،G و AIF از میتوکندری به سیتوپالسم آزاد می شود. ترکیب فسفولیپید های غشا طی آپوپتوزیس تغییر می کند مثال فسفاتیدیل سرین که در الیه سیتوزول غشا حضور دارد به الیه اگزوپالسمیک می رود که این یک پیام برای ماکروفاژهاست تا سلول مورد نظر فاگوسیتوز کنند. سلول های آپوپتوتیک فاقد التهاب در بافت اند یا التهاب کمی دارند اما در نکروز سلول های مجاور تحت تاثیر قرار می گیرند و در بافت پاسخ التهابی ایجاد می کنند. آپوپتوزیس توسط محرک هایی از جمله نبودن فاکتور رشد،تغییرات هورمونی القا می شوند اما نکروز توسط ویروس ها، تغییرات دمایی ناگهانی، کمبود اکسیژن و سموم متابولیکی در سلول پدید می آید.

کاسپازها

کاسپازها گروهی از پروتئاز های اختصاصی سیستئینی هستندکه از عوامل اصلی آپوپتوزیس محسوب می شود و به صورت گروهی در اغلب سلول ها به فرم غیرفعال وجود دارند. این آنزیم ها در روندی به فرم فعال تبدیل می شود. القا آپوپتوزیس توسط رسپتورهای مرگ سلولی منجر به فعال شدن کاسپاز های آغازگر مثل کاسپاز8 و10 می شود و این کاسپاز ها منجر به فعال شدن کاسپازهای دیگری مثل 3 یا6 وسایر کاسپاز ها می شوند.. کاسپازها 3 دمین دارند و منجر به تجزیه پروتئین بعد از ریشه آسپارتیت می شود. توالی 3 اسید آمینه قبل از آسپارتیت تعیین کننده سوبسترای اختصاصی آنهاست. کاسپازها به عنوان کلید های مرگ سلولی محسوب می شود. ساختمان کاسپازها دارای پرودمین هایی است که یک دمین اختصاصی برای اتصال پروتئین – پروتئین است ونقش مهمی در فعال سازی کاسپاز ها دارد. کاسپاز ها به صورت غیر فعال یا پروکاسپازسنتز می شوند و در پاسخ به پیام های پیش آپوپتیک فعال می شوند که این فعال سازی با ایجاد یک برش در اسید آمینه آسپارتیک اسید معمول انجام می شود. طی آپوپتوزیس به خاطر شکستگی و جدا شدن پرودمین از زیر واحد های کوچک و بزرگ، پروکاسپاز به کاسپاز فعال تبدیل می شود. در این هنگام کاسپاز فعال روی جایگاه های اختصاصی کاسپاز های دیگر اثر می گذارد و می توانند کاسپاز های پایین دست خود را فعال کند و سبب ایجاد یک آبشار پروتئولیتیکی شوند سپس کاسپاز های فعال شده، پروتئین های دیگرکلیدی را در سلول می شکنند.گروه دیگر از کاسپاز ها پروتئین هایی را می شکنند که آنزیم های تجزیه کننده DNAرا مهار می کنند وبا آزاد شدن DNase ها، DNA در هسته سلول می شکند. کاسپازها مبنای متفاوتی برای تقسیم بندی دارند که می توان انها را بر اساس ساختار، ویژگی نسبت به سوبسترا، فعالیت فیزیولوژیک و اندازه پرودمین تقسیم بندی کرد اما چیزی که در اپوپتوزیس اهمیت دارد تقسیم بندی بر اساس پرودمین آنهاست که شامل کاسپاز های آغازگر که پرودمین طویلی دارد و شامل کاسپازهای 12،10،9،8 وکاسپازهای اجرایی که پرودمین کوتاهی دارند و شامل کاسپاز های7،6،3 هستند.

مسیر های آپوپتوزیس

مسیر خارجی یا مسیر رسپتور های مرگ سلولیExtrinsic pathway  شناخته ترین گیرنده های مرگ عبارتند از: Fas/AP01/CD95 و TNF که در غشای پالسمایی اغلب سلول ها وجود ندارد. زمانیکه یک لیگاند گیرنده مربوط به خود را تحریک می کند و به آن متصل می شود این تحریک باعث به کار گیری پروتئین های آداپتور می شود.  در نتیجه پروتئین آداپتورFADD  ازناحیه C ترمینال خود به گیرنده مرگ متصل می شود، همچنین این پروتئین از ناحیه Nترمینال خود که دارای ناحیه موثر مرگ است به ناحیه مشابه درپرودمین پروکاسپاز 8یا10 متصل می شود و تشکیل کمپلکس علامت دهنده القا مرگ (DISC) را می دهند. بدین ترتیب پروکاسپازها فعال شده وبه ترتیب کاسپاز های اجرائی را فعال می کنند و آپوپتوزیس رخ می دهد.

مســیر داخلی یــا مســیر میتوکندریایــی pathway Intrinsic

در این مسیر سیتوکروم C از فضای بین دو غشای میتوکندری به داخل سلول رها می شود. در حالت عادی  Apf1 به صورت بی اثر و غیرفعال است که در حضور سیتوکرومC  فعال می شود. در ناحیه انتهای آمینی دارای دمین CARD و در انتهای کربوکسیلی دارای موتیف40WD است. سیتوکروم C مسیر بعد از میتوکندری را تحریک می کند و توالی CARD پروکاسپاز 9 به ناحیه CARD در1-Apf متصل شده و آپوپتوزوم تشکیل می شود و می تواند هفت مولکول کاسپاز 9 را فعال و سپس کاسپازهای اجرایی 3 و 7 فعال میشوندو آپوپتوزیس رخ می دهد.

خانوادهBcl-2

اعضای این خانواده در تنظیم فعال سازی پروکاسپاز ها کمک می کنند و بعضی از این اجزا مثل Bcl-2 و Bcl-xl با ممانعت از رها سازی سیتوکرومc از میتوکندری، آپوپتوزیس را مهار می کنند. بعد از فعال شدن کاسپاز 8 این پروتئاز Bid را شکسته و tBid ایجاد می کند که به طرف غشای میتوکندری رفته و به پروتئین Bax میتوکندری متصل می شود و باعث آزاد سازی سیتوکروم c می شود. tBid می تواند به xl- Bcl نیز متصل شود. در روش دیگر Bid شکسته نمی شود و در مسیر مستقل از کاسپاز از سیتوزول به میتوکندری می رود و به Bax متصل می شود و یک هترودایمر ایجاد می کند و سیتوکروم cآزاد می شود. همچنین Bad که از پروتئین های پرو آپوپتوتیک است، طی آپوپتوزیس از سیتوپالسم به میتوکندری منتقل می شود ودر سلول هایی که فاکتور رشد ندارند و نیزدر صورت بالا بودن غلظت کلسیم در سیتوپالسم یک فسفاتاز فعال شده با کلسیم به نام کلسی تونین، Bad را دفسفریله می کند و باعث انتقال Bad به میتوکندری می شود Bad با Bcl-xl هترودایمر تشکیل می دهد و باعث پیشرفت آپوپتوزیس می شود و فعالیت Bcl-2 و Bcl-xl  را خنثی می کند.  آپوپتوزیس مونومر های Baxرا از سیتوزول به غشای میتوکندریای منتقل می کند در آنجا همودایمر تشکیل می دهند و باعث رها سازی سیتوکروم c می شود. از دیگر خانواده مهم تنظیم کننده داخل سلولی آپوپتوزیس،IAPها هستند که آپوپتوزیس را مهار می کنند.

بررسی آپوپتوز با فلوسایتومتری

• فلوسایتومتری

فلوسیتومتری به طور کلی روشی برای شمارش و بررسی میکروسکوپی ذرات، مانند سلول ها و کروموزوم ها است. در این حالت ذرات و یا سلول های مورد آزمایش به صورت معلق در مایع تک تک با سرعتی حدود 5 تا 50 متر در ثانیه از مقابل پرتوی باریک از نور لیزر عبور می کنند تا اطلاعات در ارتباط با اندازه و ویژگی های مختلف تک تک سلول ها، با سرعت و دقت بالا فراهم شود. در این روش، ویژگی های فیزیکی ذره های خاص اندازه گیری و سپس تجزیه و تحلیل شود. مزيت منحصر به فرد فلوسايتومتري اين است كه مي تواند بر روي تك تك سلول ها، پارامترهاي چندگانه اي را به طور همزمان به سرعت و به صورت كمي اندازه گيري كند. این دستگاه امکان جمع آوری اطالعات مربوط به 5000 تا 50000 سلول در هر ثانیه را فراهم می کند. به طور معمول در این تکنیک، حجم مورد نیاز از نمونه مورد آزمایش خیلی کم و حدود 100 میکرولیتر است.  با این تکنیک نه تنها می توان چندین پارامتر سلولی را به صورت همزمان و سریع آنالیز کرد، بلکه می توان جمعیت های مختلف سلولی را در یک مخلوط هتروژن با کارای بالا به صورت زنده جداسازی (sorting) و جمع آوری کرد، به طوری که ذرات یا سلول های منفرد به طور فیزیکی از جمعیت های مخلوط جدا می شود. لذا، سلول های خاص می توانند برای کارهای بعدی در درون یک لوله جمع آوری شوند. استفاده از فلوسایتومتری یکی از متداول ترین تکنیک ها برای شناسایی و تمایز سلولهای مختلف در بافتهای گوناگون بوده و در بیولوژی سرطان کاربرد فراوان دارد.

ساختمان فلوسایتومتر

به طور کلی این دستگاه از 4 قسمت تشکیل می شود:

سیستم مایع ( fluidic): در این سیستم ذرات به صورت تک تک از مقابل نور منتقل می کند.

سیستم نوری: در این سیستم معمولا از لامپ های جیوه–زنون استفاده می شود. سایر لیزر ها (دیودی– آرگون– کریپتون – UV و ..) هم بنا به نیاز و یا سیستم دستگاه استفاده می شود. بنابراین، این سیستم شامل نور لیزر برای تابش به ذرات موجود در جریان مایع است.

سیستم الکترونیک: این سیستم سیگنال های نوری جمع آوری شده را به سیگنال های الکترونیک (ولتاژ) تبدیل می کند که این کار توسط آشکاسازهای نور(detectors photo )انجام می گیرد. هنگامی که سیگنال های نور به آشکارسازهای نور برخورد می کنند، این سیگنال ها به یک تعداد مناسب الکترون تبدیل می شود تا جریان الکتریکی بزرگتری را تولید کنند.

سیستم کامپیوتر: این سیستم تجزیه و تحلیل سیگنال های الکترونیکی را انجام می دهد. فرایند جمع آوری داده ها توسط فلوسایتومتر  Acquisition نامیده می شود. Acquisition با اتصال یک کامپیوتر به دستگاه و نرم افزار مربوطه آن انجام می شود.

 

اساس دستگاه فلوسایتومتری

در روش فلوسایتومتری سلول ها به وسیله آنتی بادی منوکلونال متصل به فلورسنت و فلوروکروم های متصل شونده به اجزاء سلولی رنگ آمیزی می شود، سپس سلول ها در یک جریان سیال قرار می گیرد و به صورت تک تک معمولا از مقابل پرتوی نوری لیزر در طول موج 448 نانومتر عبور می کنند. اساس فلوسایتومتری بر خصوصیات پراکنده سازی نور توسط ذرات، تحریک شدن (excitation )توسط نوری با طول موج خاص و نشر (emission )فلورسانس استوار است. متعاقب آن، نور پراکنده شده و نور فلورسانس جانبی توسط آشکار سازها جمع آوری می شوند. این آشکارسازها، سیگنال های نوری را به سیگنال های الکتریکی متناسب با نور جمع آوری شده تبدیل می کنند.

نحوه جداسازی سلول ها در دستگاه فلوسایتومتر

میزان پراکندگی نور در اثر برخورد نور لیزر هیچ ارتباطی به مقدار فلورسانس سلول ندارد و بستگی به خصوصیات فیزیکی سلول دارد که شامل اندازه و میزان گرانولیتی داخلی سلول است. لذا، شکل سلول، غشای سلول و هر نوع ماده گرانوالر داخل سلول مانند هسته در پراگندگی نور موثر است. پراکندگی نور در زاویه های مختلف می تواند سلول ها را براساس تفاوت در اندازه و پیچیدگی درونی از یکدیگرمتمایزکند. لذا، از دستگاه فلوسایتومتر برای بررسی خواص فیزیکی سلول های که با ماده فلورسنت رنگ آمیزی نشده اند می توان استفاده کرد. پس از برخورد نور به سلول و محتویات داخلی آن، به طور کلی می توان نورهای پراکنده شده (light Scattered ) از سلول را به دو دسته نور پراکنده شده به جلو (FSC) ونور پراکنده شده به اطراف (SSD )پراکنده می شود. بنابراین نور پراکنده شده متناسب با گرانولیتی داخل سلول خواهد بود. یکی از نمودارهای مورد استفاده در فلوسایتومتری، نمودار هیستوگرام است که اطلاعات تعداد سلول ها و میزان فلورسنت آنها را نشان می دهد. مقدار سیگنال فلورسنت تشخیص داده شده متناسب با تعداد مولکول های فلوروکروم است که بر روی ذرات است. در فلوسایتومتری از نمودار سه بعدیplot D-3  برای ارزیابی اطلاعات نیز استفاده می شودکه هر بعد آن یک پارامتر را نشان می دهد. مراحل ابتدایی و انتهایی آپوپتوز یا مرگ برنامه ریزی شده سلول توسط فلوسایتومتری قابل بررسی می باشد. آپوپتوز تغییرات بسیاری را در غشای سیتوپالسمی ایجاد می کند که شامل تغییرات در قابلیت نفوذپذیری و تغییرات در لیپیدهای غشای است. در اوایل آپوپتوز، فسفاتدیل سرین از سمت سیتوزولی غشای سلولی به سمت خارج غشاء انتقال می یابد. آنکسین 5 v Annexin یک پروتئین با تمایل بالا برای اتصال به فسفاتدیل سرین است، اگر این پروتئین توسط FITC نشان دار شود، مراحل اولیه آپوپتوز قابل تشخیص خواهد بود. در حین آپوپتوز نفوذپذیری غشا تغییر می کند و برخی رنگ ها قابلیت نفوذ به سلول های آپوپتوز را پیدا می کنند، در صورتی که رنگ ها قابلیت نفوذ به سلول زنده را ندارند بنابراین با رنگ PI( پروپیدیوم یدید) می توان سلول زنده از مرده و مراحل آپوپتوز را شناسایی کرد.